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    蛋白質(zhì)的測(cè)定方法

    發(fā)布時(shí)間: 2010-06-07  點(diǎn)擊次數(shù): 4483次

    pro(蛋白質(zhì))的測(cè)定方法分為兩大類:一類是利用pro的共性,即含氮量,肽鏈和折射率測(cè)定pro含量,另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定pro含量。但是食品種類很多,食品中pro含量又不同,特別是其他成分,如碳水化合物,脂肪和維生素的干擾成分很多,因此pro的測(cè)定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾,用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收,用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定,由樣品中含氮量計(jì)算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它們的基本原理都是一樣的。

    一 凱氏定氮法
       
    這種方法是1883Kjeldahl發(fā)明,當(dāng)時(shí)凱氏只使用H2SO4來(lái)分解試樣,來(lái)定量谷物中的pro,他只知用H2SO4分解試樣,而不能闡明H2SO4分解有機(jī)氮化合物生成氨的反應(yīng)歷程,所以只使用H2SO4分解試樣,需要較長(zhǎng)時(shí)間,后來(lái)由Gunning加入改進(jìn),他改進(jìn)的辦法是在消化時(shí)加入K2SO4使沸點(diǎn)上升,這樣加快分解速度,因?yàn)闇囟扔稍瓉?lái)硫酸沸點(diǎn)的380上升到400,提高了不到67所以速度也就加快了,凱氏定氮法至今仍在使用。
    我們?cè)跈z驗(yàn)食品中pro時(shí),往往只限于測(cè)定總氮量,然后乘以pro核算等數(shù),得到蛋白質(zhì)含量,實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物,故稱為粗pro。
    1
    凱氏常量定氮法:

    不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的,首先*個(gè)步驟是消化:
    1)消化:樣品與硫酸一起加熱消化,硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物,使有機(jī)物中的C、H氧化為CO2H2O蒸汽逸出,而pro則分解氮,則與硫酸結(jié)合成硫酸銨,留在酸性溶液中。
    2)在消化過(guò)程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解,它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀,可提高反應(yīng)溫度,一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330,而添加硫酸鉀后,溫度可達(dá)400,加速了整個(gè)反應(yīng)過(guò)程。此外,也可以加入硫酸鈉,氫化鉀鹽類來(lái)提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過(guò)程硫酸的不斷地被分解,水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大,沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大,否則溫度太高,生成的硫酸氫銨也會(huì)分解,放出氨而造成損失。
    為了加速反應(yīng)過(guò)程,還加入硫酸銅,氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過(guò)氧化氫,次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。
    所以有機(jī)物全部消化后,出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色,它具有催化功能,還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。
    1)蒸餾:樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨,在這操作中,一是加入氫氧化鈉溶液要過(guò)量,二是要防止樣液中氨氣逸出。
    2)吸收與滴定:
       
    蒸餾過(guò)程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收,然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過(guò)剩的硫酸或鹽酸溶液,從而計(jì)算出總氮量。
    半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng),它有吸收氨的作用。
    1
    .操作步驟:

       
    準(zhǔn)確稱取樣品中0.50-2.00g500ml凱氏瓶中10g無(wú)水K2SO4→0.5gCuSO4→20ml H2SO4→在通風(fēng)櫥中先以小火加熱,待泡沫消失后,加大火力,消化至透明無(wú)黑粒后,將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中繼續(xù)消化30分鐘至到樣液呈綠色狀態(tài),停止消化,冷卻200ml連接蒸餾裝置用硼酸作吸收液K氏瓶中加波動(dòng)珠數(shù)粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球加熱至到K氏瓶?jī)?nèi)殘液減少到三分之一時(shí),取出用水沖洗0.1N HCl滴定。
    計(jì)算:
    總氮量%= N(V2-V1)×0.014/W × 100
    0.014----
    氮的毫克當(dāng)量數(shù)

    pro%=
    總氮%×K
    乳制品K=6.38N=15.7%

    小麥粉K=5.79N=17.6%
    動(dòng)物膠K=5.6N=18.0%
    冰蛋K=6.7N=14.8%
    大豆制品K=6.016.7% K=6.25則(N=16%
    K-
    換稱等數(shù)

    各種試劑的作用:
    H2SO4

    A
    :脫水使有機(jī)物炭化,然后有機(jī)物炭化生成碳,碳將H2SO4還原為SO2,本身則變?yōu)?/font>CO2
    B
    : 氧化

    C
    pro與濃H2SO4生成NH3↑,CO2SO2,H2O↑
    D
    NH3H2SO4生成硫酸銨

    1CuSO4的作用(催化劑)
    CuSO4
    為紅色沉淀,當(dāng)C*消化后,反應(yīng)停止,紅色消失,變?yōu)樘m色,即為消化達(dá)到*,蘭色為CuSO4的顏色
    2K2SO4的作用(提高沸點(diǎn))
    沸點(diǎn)由330提高到400加速了反應(yīng)過(guò)程。
    3)硒粉和過(guò)氧化氫,氧化汞都為催化劑,但為了防止污染通常采用硫酸銅
    450%NaOH的作用
    下面我就針對(duì)幾點(diǎn)來(lái)說(shuō)明為何影響氨化*和速度快的因素:
    1K氏燒瓶和取樣量

       
    如果稱1g以上的樣品,就需要K氏燒瓶zui小500ml,800~1000ml的更好,這樣的K氏燒瓶對(duì)于縮短氨化時(shí)間,加熱的均勻性和*氨化效果。
    2)分解劑
    A H2SO4
    K2SO4的添加量
       
    有機(jī)無(wú)分解需要H2SO4量,H2SO4應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同,如果試樣含脂類高,則加H2SO4多,為了提高分解溫度,要大量添加K2SO4,但不能太多,也不能太少,太少則氨化不充分。K2SO4H2SO4的添加比例是:
    1g
    樣品 K2SO4 H2SO4=7g12ml
    這種比例在國(guó)內(nèi)外都使用,是*的

    還有一種比例: K2SO4H2SO4=1020ml
    B
    催化劑

       
    用作催化劑的有Hg、HgOSe,硒化合物,CuSO4、TiO2,對(duì)HgHgO有毒但結(jié)果好,SeCuSO4得到結(jié)果是一種,TiO2,的結(jié)果偏低,采用不同的催化劑則消化時(shí)間不同, HgO消化麥子為38,SeCuSO4消化麥子55,TiO2消化麥子70,所以在給出測(cè)定結(jié)果時(shí)要注明催化劑的類型。
    3)熱源的強(qiáng)度
       
    消化時(shí)熱源的強(qiáng)度同迅速消化和*氨化關(guān)系很大,即便鹽類K2SO4加得多,如果熱源弱,也是沒(méi)有意義的,熱源過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致H2SO4損失,使氨回收率低,另外K氏瓶的容量大小,頸部的粗細(xì)和長(zhǎng)短等,也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。
    4)氨的蒸餾和吸收及滴定
    蒸餾有兩種:
    1
    直接蒸餾(裝置簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性好)

    2
    水蒸汽蒸餾
       
    蒸餾加NaOH50%,加的量為H2SO4量的4倍,硫酸量為12ml,則NaOH12×4=48ml,而且一般高于這個(gè)理論值,即加到50~55ml,如果NaOH量加的不夠就變成H2S, H2S是強(qiáng)酸,使顏色變紅。
    吸收液有:
    1
    標(biāo)準(zhǔn)H2SO4 用標(biāo)準(zhǔn)堿返滴定,甲醛紅指示劑
    2
    硼酸 用HCl進(jìn)行滴定,混合指示劑
       
    目前都用硼酸吸收液,用硼酸代替H2SO4,這樣可省略了反滴定,H2SO4是強(qiáng)酸,要求較嚴(yán),而硼酸是弱酸,在滴定時(shí),不影響指示劑變色范圍,另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨*吸收,為保險(xiǎn)期間一般用4%
    <6>實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
    a.
    樣品應(yīng)時(shí)均勻的,若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì),液體樣要混合均勻。
    b.
    樣品放入K氏燒瓶時(shí),不要黏附瓶頸上,萬(wàn)一黏附可用少量水緩慢沖下,以免被檢樣消化不*,使結(jié)果偏低。
    c.
    消化時(shí),如不容易呈透明溶液,可將K氏燒瓶放冷后,加入30%過(guò)氧化氫催化劑2~3ml,促使氧化。
    d.
    在整個(gè)消化過(guò)程中,不要用強(qiáng)火,保持和緩的沸騰,使火力集中在K氏燒瓶底部,以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無(wú)硫酸存在的情況下,使氮有損失。
    e.
    如硫酸缺少,過(guò)多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失,這時(shí)會(huì)形成硫酸氫鉀,而不與氨作用,因此當(dāng)硫酸過(guò)多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過(guò)高時(shí),要添加硫酸量。
    f.
    混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色,如果沒(méi)有溴甲酚綠,可單獨(dú)使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。
    g.
    氨是否*蒸餾出來(lái),PH試紙檢查餾出液是否為堿性。
    h.
    向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí),往往出現(xiàn)褐色沉淀無(wú)。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng),生成氫氧化銅,經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀,有時(shí)Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。
    i.
    消化劑綠色后繼續(xù)消化30分鐘即可。
    2 K
    氏微量定氮儀法
    3 K
    氏半微量定氮儀法 (2 、 3原理一樣
       
    操作方法大同小異,半微量法消化后,定容100ml,然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。

    計(jì)算總氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100
    對(duì)于微量定氮儀法,儀器有了改進(jìn),樣液稱樣少,蒸餾消化液也少,其它基本一樣。

    4 K
    氏自動(dòng)定氮法
       
    原理與上面一樣,儀器,采用K氏自動(dòng)定氮儀:其裝置內(nèi)具有自動(dòng)加堿蒸餾裝置,自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置,消化裝置:由玻璃制成的K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。

    二 水揚(yáng)酸比色法:
    1
    原理: 樣品中的pro經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后,在一定的酸度和溫度下與水揚(yáng)酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物,可以在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定,求出樣品含氮量,計(jì)算蛋白質(zhì)含量。
    2
    方法 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
    6個(gè)25ml容量瓶編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6
    分別加空白酸液
    2ml
    分別加磷酸鹽緩沖液
    5ml
    稀釋至總體體積至
    15ml
    分別加水揚(yáng)酸鈉
    5ml
    37C
    水浴 15分鐘

    加入次氯酸鈉 2.5ml
    37C
    水浴 15分鐘

    取出試液于660nm下進(jìn)行比色,繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。
    2)樣品處理:
    準(zhǔn)確稱樣0.20~1.00gK氏瓶中15mlH2SO45g催化劑電爐上加熱到沸騰后加大火力消化直到出現(xiàn)暗綠色時(shí)搖動(dòng)瓶子→K氏瓶全部消化后冷卻加水至250ml容量瓶。
    3)樣品測(cè)定:
    準(zhǔn)確吸取上述消化溶液10ml→100ml容量瓶中定容準(zhǔn)確吸2ml→25ml容量瓶中
    5ml
    磷酸緩沖液以下操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟相同
    并以試劑空白微對(duì)照,測(cè)得樣液的光密度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其含氮量。
    4)計(jì)算
    含氮%=C×F/ W×1000×1000 × 100
    C
    ---
    從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定樣液的含氮量(Ug
    F---
    樣品溶液的稀釋倍數(shù)
    W---
    樣品重量(g
    pro%=
    總氮%×KK可為6.25,也可查)
    3
    注意事項(xiàng):
    A
    當(dāng)天消化液當(dāng)天測(cè)定,結(jié)果重現(xiàn)性好,如果樣液改至第二天比色就有變化。
    B
    當(dāng)在PH和試劑適當(dāng)范圍內(nèi)加入氯源后,顏色的顯色和溫度有關(guān),應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。
    C
    這種方法測(cè)定結(jié)果基本與K氏法一致。
    4
    試劑
    1)氯標(biāo)液:稱經(jīng)110干燥2h的硫酸銨0.4719g于燒瓶中定容10ml→此液1ml相當(dāng)于1.0mg氮標(biāo)液使用時(shí)配制成1ml相當(dāng)于2.50Ug氮標(biāo)液。
    2)空白酸液:稱0.50g蔗糖15mlH2SO45g催化劑與樣品一樣消化定容250ml→使用時(shí)吸收此液10ml→加水至100ml為工作液備用。
    3)磷酸鹽緩沖液:稱7.1g磷酸氫二鈉38g磷酸三鈉20g三九石酸鉀鈉400ml水溶解過(guò)濾另稱35gNaOH溶于100ml水中冷至室溫緩緩地?cái)嚢杓尤肓姿猁}溶液中加入水稀釋至1000ml備用。
    4)水揚(yáng)酸鈉溶液:稱25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于200ml水中過(guò)濾,加水稀釋至500ml
    5)次氯酸鈉溶液:吸4ml安替富民液,用水稀釋至
    100ml
    5
    儀器

    1)分光光度計(jì)
    2)恒溫水浴
    三 紫外分光光度法
    1
    原理:
        pro
    及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)基 ,在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)某一波長(zhǎng)具有一定的光選擇吸收,在280nm下,光吸收與pro濃度(3~8mg/ml)成直線關(guān)系,因此,通過(guò)測(cè)定pro溶液的吸光度,并參照事先用K氏定氮法分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)的含量。
    2
    試劑:
    1 0.1mol/l檸檬酸水溶液。
    28mol/l[NH22CO]2NNaOH溶液。 脲的2N氫氧化鈉液
    3 95%乙醇
    4) 無(wú)水乙醚
    3
    儀器
    1 751型的紫外分光光度計(jì)

    2) 離心機(jī)
    4
    操作方法
    1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取樣品.2.00g,置于50ml燒瓶中,加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml,攪拌30分鐘使其充分溶解,用四層紗布過(guò)濾于玻璃離心管中,以每秒鐘3000~5000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘,分別吸出上清夜0.5,1.01.5,2.02.5,3.0ml6個(gè)10ml容量瓶鐘,每個(gè)容量瓶,8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘(如果離心再次離心),取透明液于比色皿中,在280nm下測(cè)定其吸光度。(做參比值)
    以事先用K氏定氮法測(cè)定的樣品中蛋白質(zhì)的含量微橫坐標(biāo)上面的吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
    2)樣品測(cè)定
    準(zhǔn)確稱取試樣1.00g50ml燒杯中0.1mol/l檸檬酸溶液30ml→攪拌10分鐘四層紗布過(guò)濾到離心管中8mol/L脲的NaOH溶液定容,搖勻后于280nm下測(cè)吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出pro的含量。
    計(jì)算: 蛋白質(zhì)= C/W× 100  
    C----
    從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的pro含量(mg
    W----
    測(cè)定樣品溶液相當(dāng)于樣品量(mg
    說(shuō)明:
    a.
    此法運(yùn)用于糕點(diǎn),牛乳和可溶性pro樣品,測(cè)定糕點(diǎn)時(shí),應(yīng)把表皮顏色去掉。
    b.
    溫度對(duì)pro水解有影響,操作溫度應(yīng)控制在20~30。
    四 雙縮脲法-皮尼克法
    1
    原理:
       
    雙縮脲在堿性條件中,能與CuSO4結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似,也呈此反應(yīng)。本法直接用于測(cè)定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩(wěn)定劑,酒石酸鉀鈉比甘油好些。小麥粉中的pro能直接地一邊抽出一邊進(jìn)行定量。
    2
    試劑
    甘油作為穩(wěn)定劑:取10ml10N KOH溶液,3.0ml甘油加到937ml水中,激烈攪拌,同時(shí)加入4%CuSO450ml。
    酒石酸鈉作穩(wěn)定劑,吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中,激烈攪拌,同時(shí)加入4%CuSO440ml。
    配制以上兩種溶液、試劑,必須澄清,無(wú)氫氧化銅生成,否則重配。
    3
    方法:樣品測(cè)定
    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
    準(zhǔn)確稱0.6g樣品使用試劑(1
    準(zhǔn)確稱0.5g樣品使用試劑(2
    假如用試劑(2
    1)準(zhǔn)確稱樣0.5g80ml離心管1mlClC4→混合50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑蓋上蓋子離心10min4000轉(zhuǎn)/分)放置1小時(shí)吸混合液15ml→20ml離心管中離心到*透明取上清夜5ml→10ml容量瓶加水定容550nm處測(cè)定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出pro含量。
    2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
    按樣品測(cè)定方法,根據(jù)樣品中pro含量,取離心澄清樣液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml10ml容量瓶中分別加水定容,按照樣品測(cè)定其吸光度。
    事先用K氏定氮法測(cè)定樣品中pro含量為橫坐標(biāo),以上述吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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